请教克隆
我有两个片段想链接一起，一个（vector）大概9.5kb，另外一个（insert）4kb.都是NotI酶切的.怎么就连不起来呢？连了快2个月了.有时候有克隆但是都不是positiv.请有经验的前辈帮忙.是不是加PEG6000增加粘稠度可以提高可能啊！ 你的vector用酶切了以后 是怎么纯化的呢？是用胶回收的kit么？9.5kb如果用kit回收很容易会吧粘端损坏掉（虽然说明书上说不会），还有酶切有没有过度？ 是先跑胶然后用kit，还用cip了，也曾经不用cip过，但是有negativ克隆，就是说vector自己连了，可是就是没有insert，气死了，到现在共挑了100多个克隆了，惨啊，，，，，， 对了，用的酶是NotI 载体酶切之后要去磷酸化了吗，否则肯定是载体自连的比较多了 首先你的连接我弄不明白为什么连不上，想问下你，你做了载体和insert的比较了吗，可以通过跑胶，取载体和insert 各0，5ul，1ul，2ul，然后比较下，他们的intensitaet，vector和insert在多少ul情况下相当，然后你的vector和insert大小都知道，最后的比例是10比1，计算出你要加的vector和insert的最佳量去连接，这样肯定没问题。再告诉你个方法，不用浪费时间挑那么多个Negativ klon，在你的Ligation之后，可以再选择一个酶，这个酶只切你vector不要的那段，不切vector你要的那段和你的insert，通过这次酶切，可以把没有你insert的vector排出，不至于最后没有posivtiv的klon，还要挑那么多，真累人。不知道说明白没，你去试验一下吧。 感觉楼主的问题很可能是DNA片断的质量不够好，可以试试跑CRYSTALVIOLET胶来纯化。 多谢各位帮忙，楼上crystalviolet胶没有做过，可以说详细些吗？
我的克隆其实很简单，就是vector用NotI切一下，就成线性DNA了，大概9.5KB，Insert，3.5kb是在Topo 里面，用NotI切一下后跑胶提取我想要的片段后两者一连接就可以了，非常非常简单滴，但是就是做不出来，是不是NotI不好连啊？
楼上的楼上是说ligation的产物再用酶切吗？然后把酶切后的产物transformation吧？可是ligationbuffer和酶的buffer肯定不兼容，如果再过柱的话是不是DNA太少了？
对了，我的vector是用过CIAP的了。
多谢大家了！ lz, 如果第一次失败，后面就要做negative control了。
如果negative control上的克龙跟你的ligation差不多多，那就没必要挑了。 有时候control上比较少些克隆啦，做了N次。是不是两个片段太大就不好连接啊？
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