bamboode 发表于 2009-8-30 09:27

多谢各位帮忙，楼上crystalviolet胶没有做过，可以说详细些吗？
我的克隆其实很简单，就是vector用NotI切一下，就成线性DNA了，大概9.5KB，Insert，3.5kb是在Topo 里面，用NotI切一下后跑胶提取我想要的片段后两者一 ...
168 发表于 2009-8-29 21:00 http://www.dolc.de/forum/images/common/back.gif

对，Ligation后，要柱子纯化，然后再酶切，再纯化。损失这点不算什么，最后哪怕一个盘子上面长一个klon是对的，也算你成功了，不至于挑那么多Negativ的，你说呢！

168 发表于 2009-8-30 10:39

楼上说得对，就是这条用在我的克隆上不行的，因为，所有vector我都要的。不过还是要多谢你的tip，以后克隆可以用的。{:5_394:}

cihui_2008 发表于 2009-8-30 10:53

有时候control上比较少些克隆啦，做了N次。是不是两个片段太大就不好连接啊？
168 发表于 2009-8-30 05:30 http://www.dolc.de/forum/images/common/back.gif

楼主的这种情况的确不是很容易的克隆，因为片断比较大，连接反应用量要比较大的，不知道楼主有没有考虑这个问题。9.5KB的话，我估计一个10µl反应得用150ng. 关于CRYSTALVIOLET胶，如果楼主感兴趣，给我个短信，我可以把protocol发给你。

junhuaq 发表于 2009-8-30 11:48

lz,negative control要做足，backbone的，insert的，甚至buffer的，如果问题不是在negative control里就赶早换strategy吧。克龙有时候要碰点运气的。一个克龙上就花2个月，你的进度得延后多少啊。

recet 发表于 2009-8-30 12:01

One of the possible reason might be that the PCR insert is not efficiently digested. Try to extend the the overhang to 10nt and NotI digestion for O.N.

Or, try to clone the insert into an intermediate vector, then re-clone to the target.

Good Luck!

一两行 发表于 2009-8-30 16:44

LZ纯化9.5kb的时候可以这样， 做一块0.8%的大胶，不加EB，然后把样品分成两份跑过夜，这样可以一定程度上分离开没有被切完的的vector（超螺旋等等），然后切一个泳道的胶下来放进EB incubate一段时间，在紫外下看看9.5kb的band在哪里，然后在胶上作一个记号，在把这块胶拿回去和没有EB的胶比对一下，把另外一个泳道的band根据你做的记号大概的切下来，这样做是为了不在你切胶的时候DNA被UV破坏，然后用原始的phenol法把DNA纯化出来，这样你会得到很纯的DNA，而且没有损伤，但是缺点是量比较小，所以要多准备一些样品，下面再进行正常的连接就行了。希望对你有帮助。

168 发表于 2009-8-30 17:44

lz,negative control要做足，backbone的，insert的，甚至buffer的，如果问题不是在negative control里就赶早换strategy吧。克龙有时候要碰点运气的。一个克龙上就花2个月，你的进度得延后多少啊。
junhuaq 发表于 2009-8-30 12:48 http://www.dolc.de/forum/images/common/back.gif
我不止做了2个月了。{:4_300:}

orionsnow 发表于 2009-8-31 00:10

看不懂你们在干什么啊，我匿了

cihui_2008 发表于 2009-8-31 08:36

LZ纯化9.5kb的时候可以这样， 做一块0.8%的大胶，不加EB，然后把样品分成两份跑过夜，这样可以一定程度上分离开没有被切完的的vector（超螺旋等等），然后切一个泳道的胶下来放进EB incubate一段时间，在紫外下看看9 ...
一两行 发表于 2009-8-30 17:44 http://www.dolc.de/forum/images/common/back.gif

这种方法可以代替CRYSTALVIOLET胶，目的都是保护大片段不受UV的损害。

cihui_2008 发表于 2009-8-31 08:44

Crystal violet 胶
Exposure to UV light may damage nucleic acids. Crystal violet does not require excitation by UV light and was therefore used to visualize large DNA fragments or long PCR products to be purified. The disadvantage of crystal violet is a much lower sensitivity compared with ethidium bromide. To be visible, a minimum 200 ng DNA is required. A white background helps to improve visibility. The final concentration of the stain, in the gel as well as in the running buffer, was 10 µg/ml.
基本步骤同一般的胶是一样的，但是使用结晶紫代替EB。
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